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생명과학 정보의 창

밴드가 잘 나오지 않았다면 Transfer 과정을 다시 복기해보자 Western blot에서 antibody 반응까지 제대로 했는데 밴드가 뜨지 않는 경우가 있다.이럴 땐 항체를 의심하기 전에 transfer 단계에서 단백질이 PVDF나 nitrocellulose membrane으로제대로 옮겨졌는지부터 확인해야 한다. 특히 고분자 단백질(high molecular weight protein)은 transfer가 어렵기 때문에 실험 조건 최적화가 매우 중요하다. 고려사항 (No.1~No.3) 1. Transfer 세팅 확인Wet transfer vs. semi-dry transfer 두 가지 방식이 있다.두 방식의 차이점으로는 wet transfer는 시간이 오래 걸리지만 효율이 좋고, semi-dry는 ..

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프로테아제 억제제를 넣지않을 경우 단백질 분해의 위험성세포 및 조직에서 추출한 단백질은 분해될 가능성이 있다.단백질을 추출할 때 가장 중요한 건 분해를 방지하는 것이다.특히 lysate에 녹아있는 단백질 분해효소(protease)는 세포가 파괴되는 순간 활성화되어,실험 준비하는 동안에도 target protein을 서서히 분해시킨다. 이 때문에 protease/phosphatase inhibitor cocktail을 lysis buffer에 반드시 넣어줘야 한다. 프로테아제 억제제의 역할과 넣지 않았을 때의 리스크 1. protease/phosphatase inhibitor cocktail 의 종류 대표적인 cocktail 구성에는 serine protease, cysteine protease, met..

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단백질 정량 실수로 망치는 시그널Western blot 시그널 안 나올 땐 단백질 정량부터 다시 생각해보시길 권장드립니다.정량후 단백질도 제대로 넣었는데 밴드가 잘 detection 되지 않는 경우가 있으시죠?저도 실험할 때 한 번쯤 해본 고민입니다. 알고 보면 가장 기초적인 ‘단백질 정량’에서 이미 문제가 시작됐을 수 있어요.Western blot에서 시그널이 안 보일 땐 가장 먼저 정량 정확도와 로딩량을 의심해봐야 합니다.정량의 중요성Western blot은 정량분석이 아니라 정성분석(qualitative) 중심이라, 정확한 단백질 양을 넣어주지 않으면 아무리 항체가 좋아도 시그널이 약하게 뜨거나 아예 안 뜰 수 있습니다.보통 세포추출 단백질의 경우 20–30 µg 정도를 로딩하면 안정적인 시그널이..

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RNA를 추출할 때 사용되어지는 각 시약의 역할과 원리에 대해서 알아봅니다. RNA 추출원리는 세포, 조직 및 액체시료에서도 동일하게 작용을 하며 각 단계가 어떻게 작용이 확인합니다. RNA 추출의 전체적인 요약 Trizol의 많은 성분 중에서 퀴니딘 이소티오시아네이트 (quinidine isothiocyanate)는 강력한 RNase 억제제이며 페놀은 세포 내 단백질과 지질을 분해합니다. 파쇄된 혼합물에 클로로포름 (Chloroform)을 첨가하면 수층과 유기층으로 분리되고, 이소프로필알코올 (isopropanol)로 침전시켜 수층에 존재하는 RNA를 분리합니다. 침전된 RNA는 TE 완충액이나 RNase가 없는 물에 용해하여 얻을 수 있으며 추출 과정에서 시약에 의해 RNA가 변성되는 것을 방지하여 ..