[WB] 단백질 정량 실수 - BCA 정량 꿀팁 총정리 (Trouble shooting-1)

단백질 정량 실수로 망치는 시그널

Western blot 시그널 안 나올 땐 단백질 정량부터 다시 생각해보시길 권장드립니다.
정량후  단백질도 제대로 넣었는데 밴드가 잘 detection 되지 않는 경우가 있으시죠?
저도 실험할 때 한 번쯤 해본 고민입니다.

 

알고 보면 가장 기초적인 ‘단백질 정량’에서 이미 문제가 시작됐을 수 있어요.

Western blot에서 시그널이 안 보일 땐 가장 먼저 정량 정확도와 로딩량을 의심해봐야 합니다.

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Western blot

정량의 중요성

Western blot은 정량분석이 아니라 정성분석(qualitative) 중심이라, 

정확한 단백질 양을 넣어주지 않으면 아무리 항체가 좋아도 시그널이 약하게 뜨거나 아예 안 뜰 수 있습니다.

보통 세포추출 단백질의 경우 20–30 µg 정도를 로딩하면 안정적인 시그널이 나옵니다.

 

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BCA vs Bradford assay의 비교

 

요즘은 단백질 정량할 때 BCA assay가 가장 많이 사용됩니다.
BCA assay는 SDS, Triton-X 같은 detergent에 강해서 lysis buffer를 그대로 써도 정량이 가능합니다.
반면, Bradford는 정량값이 buffer에 쉽게 영향을 받아 부정확할 수 있어서 특히, NP-40이나 RIPA buffer 환경에서는 추천드리지 않습니다. 각 실험에 대한 protocol은 정리후 업데이트 예정입니다.

 

팁으로

BCA assay는 colorimetric assay라 spectrophotometer보다 plate reader를 사용하는 것이 더 안정적이며

최소 2~3회 반복 정량 후 평균값을 사용하는 게 좋습니다.

 

정량 잘했는데도 안 보인다면,

샘플을 준비과정에서 protein이 degradation 될 가능성도 있습니다.

실수로 loading할 때 정확한 양의 단백질 양을 넣어주시구요
또는 단백질이 정말 low-expression이거나 rare한 경우도 있습니다.

이럴 경우에는 단백질 농축을 하거나, 콤에 따른 로딩량을 잘 고려하셔서 단백질양을 30~50 µg까지 늘려보는 것도 괜찮습니다.
**Housekeeping 단백질 (GAPDH, β-actin)**로 로딩 이상 여부도 꼭 확인해야 합니다.

 

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마무리 요약

체크 포인트 추천
1. 정량 방법 BCA assay (detergent에 강함)
2. 정확한 로딩량 보통 20–30 µg
3. 정량 반복 최소 3회 후 평균값
4. 실험 오류 방지 로딩 시 pipette 체크, ladder 옆에 넣기