[WB] 프로테아제·포스파테이즈 억제제, 언제 어떻게 넣어야 할까? (Trouble shooting-2)

 

프로테아제 억제제를 넣지않을 경우 단백질 분해의 위험성

세포 및 조직에서 추출한 단백질은 분해될 가능성이 있다.
단백질을 추출할 때 가장 중요한 건 분해를 방지하는 것이다.

특히 lysate에 녹아있는 단백질 분해효소(protease)는 세포가 파괴되는 순간 활성화되어,

실험 준비하는 동안에도 target protein을 서서히 분해시킨다.

이 때문에 protease/phosphatase inhibitor cocktail을 lysis buffer에 반드시 넣어줘야 한다.

 

 

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왼: 밴드 smear / 오: 정상 밴드

프로테아제 억제제의 역할과 넣지 않았을 때의 리스크

 

1. protease/phosphatase inhibitor cocktail 의 종류
대표적인 cocktail 구성에는 serine protease, cysteine protease, metalloprotease 억제제가 포함된다.
흔히 사용되는 상품으로는 Roche Complete™, Thermo Halt™ 등이 있다.

보통은 Roche에서 나오는 테블렛 제품을 lysis buffer에 Stock solution으로 녹여

working solution으로 희석해서 쓰는 방식으로 진행하였다. 

 

2. 억제제를 안 넣었을 때 나타나는 결과
가장 흔한 증상은 Western blot에서 Target protein 밴드가 뜨지않거나 밴드가 smear 형태로 detection이 된 경우도 있었다.  
저분자 단백질일수록 더 빨리 분해되며, 일관된 정량이 어렵다.

 

3. 단백질 안정화를 위한 추가 
Lysis buffer를 만들 때 즉시 억제제를 섞고 본 용액을 기반으로 Cell extraction 후 바로 ice 위에서 유지하는 것이 중요하다.
추출 후 원심분리하여 상층액만 따로 모아 단백질정량을 수행하고 샘플링까지 진행하는 것이 좋으며,

그 후 보관은 -80℃ 보관하는 것이 best practice다.

 

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* 억제제는 옵션이 아니라 필수

protease/phosphatase inhibitor 는 단순한 옵션이 아니라 타겟으로 하는 단백질 신호를 얻기 위한 최소 조건이다.

한 번 실수로 빠뜨리면 실험을 처음부터 다시 해야 할 만큼 시간과 노력이 많이 들어간다.

특히 신호전달 단백질, 효소, cleavage form 단백질 등은 분해 민감도가 높아 항상 inhibitor 사용이 필수다.