[WB] Transfer시 고려 사항 (Trouble shooting-3)

밴드가 잘 나오지 않았다면 Transfer 과정을 다시 복기해보자

 

Western blot에서 antibody 반응까지 제대로 했는데 밴드가 뜨지 않는 경우가 있다.

이럴 땐 항체를 의심하기 전에 transfer 단계에서 단백질이 PVDF나 nitrocellulose membrane으로

제대로 옮겨졌는지부터 확인해야 한다.

 

특히 고분자 단백질(high molecular weight protein)은 transfer가 어렵기 때문에 실험 조건 최적화가 매우 중요하다.

 

---

Western blot Transfer

고려사항 (No.1~No.3)

 

1. Transfer 세팅 확인

Wet transfer vs. semi-dry transfer 두 가지 방식이 있다.

두 방식의 차이점으로는 wet transfer는 시간이 오래 걸리지만 효율이 좋고, 

semi-dry는 빠르지만 고분자 단백질 전이시 단백질 손실 위험이 있다.

보통 연구실에서 주로 사용하는 방식이 있기에 그에 따라 사용하면 된다.

 

---

 

2. Membrane 종류

웨스턴블롯에서 사용되는 membrane은 주로 PVDF와 nitrocellulose 이다.

PVDF membrane은 단백질 결합력이 강하고 내구성이 뛰어나 고분자 단백질에 적합합니다. 

단, 사용 전 100% methanol로 5~15분간 pre-wet을 반드시 하여 사용해야 한다.

단백질의 전기적 성질에도 덜 영향을 받아 다양한 buffer 조건에서도 안정적이다.

반면 nitrocellulose membrane은 취급이 간편하고 background이 적어 깔끔한 이미지를 얻기 쉽다.

하지만 고분자 단백질 전이 효율은 상대적으로 낮을 수 있습니다.

따라서 실험 목적과 타깃 단백질의 분자량에 따라 membrane을 선택하는 것이 매우 중요하다.

 

---

 

 

 

3. Transfer 시간과 전류 설정

일반적으로 100 V, 1시간 전이가 일반적이나, 고분자 단백질은 30 V로 overnight 전이를 하는 경우도 있었다.
Transfer condition optimization은 반드시 target protein 크기에 따라 맞춰야 한다.

Target protein 크기에 따른 조건

- 저분자 단백질 (30~50kDa 이하): 100V, 45~60분
- 중·고분자 단백질 (50kDa~ 이상): 100V, 1시간 반~2시간 or 30V, overnight (약 12~16시간)

- 간혹 시간을 늘려 transfer 하였는데도 겔에 밴드가 남아있는 경우를 볼 수 있다 (size ladder기준).

이럴 때는 전압보다 전류조건을 0.45mA로 설정하여 넘겼을 때 밴드가 완전히 전이됨을 확인하였다.  

 

* 안정적이며 전이 효율이 높지만, 시간이 오래 걸리고 열이 많이 발생하므로 냉각이 반드시 필요하다.

전류가 너무 강하거나 시간이 짧으면 전이가 불완전할 수 있고, 

반대로 과도하게 오래 진행하면 단백질이 membrane을 지나쳐 흘러버릴 수 있으므로 주의가 필요하다.

Buffer 조성, gel 두께, 기기 성능 등도 함께 고려해야 한다.

---

정리

밴드가 보이지 않을 때 흔히 항체나 시약만 점검하지만, 

transfer 자체가 안 되었을 가능성을 항상 염두에 두어야 한다. 

Transfer 조건, membrane 선택, 전류 시간 조절 등을 통해 실험 정확도를 높이고, 

특히 고분자 단백질의 경우 transfer 효율을 높이기 위한 추가 조건 최적화가 필요하다.